当稻瘟病菌的孢子悄然落在水稻叶片上，这场持续了数百万年的"攻防战"便再次拉开序幕。这种由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病，每年导致全球水稻减产10%-30%，堪称水稻的"头号杀手"。植物与病原菌的相互作用如同精密的军事防御系统，包含三层关键防线：病原体相关分子模式（PAMPs）触发的免疫（PTI）、效应因子触发的感病性（ETS）以及效应因子触发的免疫（ETI）。然而，在这三层防御网络中，小分子RNA（microRNA）如何协同调控不同层次的免疫反应，至今仍是未解之谜。以往研究表明，水稻中已有70多种microRNA对稻瘟病菌感染产生响应，其中16种为负调控因子（如miR156、miR164a等），9种为正调控因子（如miR159a、miR160a等）。但这些microRNA究竟作用于哪一层免疫反应？它们之间是否存在协同或拮抗关系？
这些问题一直困扰着植物免疫领域的研究者。为此，实验室李燕/王文明教授团队在《Rice》发表最新研究成果。研究团队运用小RNA测序技术，分别构建了PTI（LTH品系几丁质处理）、ETS（LTH接种致病菌Guy11 vs 非致病菌ΔMoelo）和ETI（转基因株系Piz-t:HA接种相容菌RB22 vs 不相容菌RB22(AvrPiz-t)）三种互作场景下的15个小RNA文库。通过主成分分析验证样本可靠性后，采用差异表达分析（p<0.05，Fold change>2或<0.5）筛选特异性microRNA，并结合转基因过表达、活性氧（ROS）爆发检测、防御基因表达分析、离体HR反应等实验验证功能，通过多维度实验设计揭示了microRNA调控三层免疫网络的奥秘。
结果
（1）水稻PTI中发挥作用miRNA的鉴定 通过比较几丁质处理与对照样本，研究发现6 hpt（小时处理后）有13个microRNA发生显著变化，其中miR1320-5p和miR398b等10个上调，miR166g-5p等3个下调。RT-qPCR验证显示几丁质显著诱导miR1320-5p表达。过表达株系OX1320表现出更强的flg22和几丁质诱导的ROS爆发及防御基因（OsKS4、OsNAC4、PR1a）上调，证实其正调控PTI。而miR396家族过表达株系（OX396a/c）的ROS爆发与对照无显著差异，提示该家族可能不直接参与PTI。
图1. 水稻PTI相关miRNA的鉴定。 (A) 小RNA测序结果热图，显示LTH经几丁质处理与未处理条件下差异表达的miRNA。颜色表示各miRNA的fold-change（Log2尺度）。(B) RT-qPCR数据显示LTH在几丁质处理或未处理条件下0、3、6小时各miRNA的相对水平。(C-D) 分别显示过表达miR1320的转基因系（OX1320）和Kasalath对照叶片中PAMP触发的活性氧（ROS）迸发。数据显示为平均值±标准差（n=4次独立重复）。左侧图显示各时间点的相对ROS水平，右侧图显示ROS总计数。(E-G)经或未经几丁质处理的OX1320和Kasalath对照中PTI相关基因（OsKS4, OsNAC4, PR1a）的mRNA水平。数据显示为平均值±标准差（n=3个独立样本）。图B-G中，柱子上方不同字母表示通过单因素Tukey–Kramer检验确定的显著差异（P < 0.01）。
(2) 水稻ETS中发挥作用miRNA的鉴定 对比Guy11与ΔMoelo感染样本，发现30个ETS相关microRNA（23个上调、7个下调）。功能验证显示，过表达miR171b（OX171b）和miR172a（OX172a）株系对Guy11抗性增强（病斑减小、菌量降低），而对ΔMoelo反应无变化，说明二者通过抑制ETS增强抗性。相反，过表达miR396（OX396）和miR164a（OX164a）株系对Guy11感病性增强，且ΔMoelo在OX164a中出现轻微生长，提示miR164a可能促进效应因子分泌。
图2. ETS相关miRNA的鉴定。 (A) 小RNA测序结果热图，显示LTH接种稻瘟病菌强毒力菌株Guy11或非致病突变体∆Moelo后差异表达的miRNA。颜色表示各miRNA的 fold-change（Log2尺度）。(B) 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）数据显示LTH接种Guy11或∆Moelo后0、12、24小时各miRNA的相对水平。(C, E, G, I) 指定miRNA过表达系及日本晴对照在接种Guy11或∆Moelo后的病害症状。病害表型记录于接种后5天（OX171b, OX172a, OX396）或7天（OX164a）。比例尺：1厘米。(D, F, H, J) 分别为图C, E, G, I中指定miRNA过表达系及日本晴对照的相对真菌生物量。图B, D, F, H, J中，数据显示为平均值±标准差（n=3个独立样本），柱子上方不同字母表示通过单因素Tukey–Kramer检验确定的显著差异（P < 0.01）。
(3) 水稻ETI中发挥作用miRNA的鉴定 在ETI模型中，RB22(AvrPiz-t)感染引发14个microRNA差异表达（7个上调、7个下调）。本氏烟瞬时表达实验发现，miR166j加速Avr-PikD/Piks触发的HR（过敏反应）和离子渗漏，而miR396c和miR169a延迟HR。过表达miR169a（OX169a）和miR396（OX396）株系对不相容菌株FJ81278感病性增强，证实二者通过抑制ETI削弱抗性。
图3. ETI相关miRNA的鉴定。 (A) 小RNA测序结果热图，显示表达Piz-t的转基因系（Piz-t: HA）接种稻瘟病菌强毒力菌株RB22或携带AvrPiz-t的不亲和菌株（RB22(AvrPiz-t)）后差异表达的miRNA。颜色表示各miRNA平均积累量的 fold-change（Log2尺度）。(B) 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）数据显示Piz-t系接种RB22或RB22(AvrPiz-t)后0、12、24小时各miRNA的相对水平。(C) 在本氏烟叶片中瞬时共表达Avr-Piks和Piks，并加入或不加入指定miRNA后的细胞死亡表型。(D) 图C中叶片的离子电导率。(E, G) 指定品系及其对照在接种稻瘟病菌强毒力菌株GZ8和不亲和菌株FJ81278后的病害症状。病害表型记录于接种后5天。比例尺：1厘米。(F, H) 分别为图E和G中指定品系及其对照的相对真菌生物量。图B, D, F, H中，数据显示为平均值±标准差（n=3个独立样本），柱子上方不同字母表示通过单因素Tukey–Kramer检验确定的显著差异（P < 0.01）。
(4) 交叉调控机制解析 维恩分析揭示miR397b和miR408-5p为ETS-ETI共享调控因子。过表达株系OX397b和OX408对GZ8（致病菌）和FJ81278（不相容菌）感病性均增强，且显著抑制Avr-PikD/Piks触发的HR。而miR398b作为唯一的三层共享因子，过表达株系OX398b不仅增强PTI相关ROS爆发，还对GZ8、NC-10（致病菌）和FJ81278均表现抗性，同时延迟HR反应，呈现"促PTI-ETI/抑ETS"的广谱抗病特性。
图4. miR397b和miR408-5p增强ETS但抑制ETI。 (A) 韦恩图显示与ETS和ETI均相关的miRNA数量。(B, C) 过表达MIR397b（OX397b）或MIR408（OX408）的转基因系中miR397b和miR408-5p的丰度，与日本晴对照比较。(D) OX397b、OX408及日本晴对照在接种稻瘟病菌强毒力菌株GZ8、非致病突变体∆Moelo和不亲和菌株FJ81278后的病害症状。病害表型记录于接种后5天。比例尺：1厘米。(E) 图D中指定品系的相对真菌生物量。(F) 在本氏烟叶片中瞬时共表达Avr-Piks和Piks，并加入或不加入指定miRNA后的细胞死亡表型。(G, H) 图F中叶片的离子电导率。图B, C, E, G, H中，数据显示为平均值±标准差（n=3个独立样本），柱子上方不同字母表示通过单因素Tukey–Kramer检验确定的显著差异（P < 0.01）。
图5. miR398b调控PTI、ETS和ETI。 (A) 韦恩图显示与PTI、ETS和ETI三者均相关的miRNA数量。(B)过表达MIR398b的转基因系（OX398b）和Kasalath对照叶片中PAMP诱导的活性氧（ROS）迸发。左侧图显示各时间点的相对ROS水平，右侧图显示ROS总计数。(C) OX398b和Kasalath对照在接种稻瘟病菌强毒力菌株GZ8和NC-10、非致病菌株∆Moelo及不亲和菌株FJ81278后的病害症状。病害表型记录于接种后5天。比例尺：1厘米。(D) 图C中指定品系的相对真菌生物量。(E) 在本氏烟叶片中瞬时共表达Avr-Piks和Piks，并加入或不加入miR398b后的细胞死亡表型。(F) 图E中叶片的离子电导率。图B, D, F中，数据显示为平均值±标准差（图B为n=4个独立样本，图D, F为n=3次独立重复），柱子上方不同字母表示通过单因素Tukey–Kramer检验确定的显著差异（P < 0.01）。
结论
本研究首次绘制了水稻-稻瘟病菌互作中microRNA调控三层免疫的网络图谱，发现48个关键microRNA通过协同或拮抗作用精细调控PTI、ETS和ETI。特别值得注意的是，miR397b和miR408-5p采用"增强ETS/抑制ETI"的双刃剑机制促进感病，而miR398b通过三重调控实现广谱抗性。这些发现不仅解释了植物如何平衡不同层次免疫反应这一长期难题，更为设计多层级抗病育种策略提供了理论依据。该研究建立的ΔMoelo突变体实验体系，为区分PTI与ETS提供了创新工具，而miR1862e等未表征microRNA的发现，预示着该领域仍有大量新调控因子待挖掘。
文章链接：https://thericejournal.springeropen.com/articles/10.1186/s12284-025-00855-8
